3、保存條件

一、得率低或純化不到質粒？

1) 質粒丟失：

在含有新鮮抗生素的平板上重新劃甘油菌培養。若當前使用的是氨芐青霉素，可以考慮試用羧芐青霉素。如果有必要，可重新轉化質?；蚴褂貌煌乃拗骶?。

2) 細菌裂解不完全：

①　菌量過多：將菌量減少為原先的一半（實際操作中可按實驗情況相應調整）。

②　Buffer P2 過期：Buffer P2 中的NaOH 被空氣中的CO2 中和使用完要立即擰緊瓶蓋。

3) 細菌重懸不完全：

在加入 Buffer P1 后注意觀察細菌是否完全懸浮、是否有菌塊殘留。

4) 質粒過早的被洗脫:

確保 buffer P2 中已經加入正確體積的95-100%無水乙醇。

5) 洗脫效率低:

膜過干:①制備管在負壓裝置上抽干時間不宜過長。②洗脫液或者去離子水 65℃ 預熱以及增加洗脫時間至 5min 都可提高洗脫效率。

二、DNA純度低？

高純度的質粒A260/280比值通常在1.7-1.9之間。低于1.7考慮蛋白質污染，高于1.9考慮RNA 污染。

1) A260/280 比值過低：表現為瓊脂糖凝膠電泳的背景底色亮和酶切效率低

①　菌量過多。

②　加入Buffer P1后菌體未完全懸起。

③　加入Buffer P2后裂解不完全。

④　加入Buffer P3后中和不完全。

2) A260/280 比值過高：表現為電泳時會出現 RNA 條帶。

①　Buffer P1 中未加入RNase A。

②　Buffer P1 保存不當，或者已經過期，RNase A 活性下降。

③　菌量過多。

④　加入Buffer P1 后菌體沒有完全懸起。

加入 Buffer P2 后裂解不完全。

三、瓊脂糖凝膠電泳出現多個條帶?

正常質粒電泳會出現多條帶。清晰的主帶是質粒的超螺旋結構。在超螺旋主帶的上方通常有 1-3 條電泳更慢的條帶，一般認為是開環質粒和質粒二聚體（或者不同的交聯形式）。偶爾也會有在超螺旋條帶前面出現微弱的稱為“不可逆變性質?！睏l帶，這個是堿裂解的副產品。大多數酶對這種質粒不起作用，包括限制性和測序的酶。如果在環境中時間過長，會使得會使得不可逆變性的質粒含量增加。

此時建議Buffer P2 裂解不要超過 5min.。

四、瓊脂糖凝膠電泳背景底色亮？

細菌碎片、基因組和RNA 污染都顯現高亮電泳背景。

1) 培養時間過長，大量細菌死亡和產生大量菌體碎片。

2) 收集的細菌保存/處理時間過長。

3) 保存收集細菌的方法不對。

4) 菌量過多。

5) 加入Buffer P2 后裂解不完全。

6) 加入 Buffer P3 后中和不完全。